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"Leben auf schleimigem Fuß"
Ökophysiologie limnischer Gastropoden

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Material und Methoden I

Beschreibung der Methoden

Inhalt:

Ionen - Kapillar - Elektrophorese
Mit Hilfe der Ionen-Kapillar-Elektrophorese ist es möglich, kleine Ionen in einer Lösung zu identifizieren und quantifizieren.
Der Versuchsaufbau besteht aus zwei mit Puffer gefüllten Gefäßen, die über eine Kapillare mit einem Durchmesser von 75 µm verbunden sind. Man legt eine Spannung an die Lösung, indem man in ein Puffergefäß eine Kathode und in das andere eine Anode taucht, und erhält so ein elektrisches Feld, in dem die Ionen, entsprechend ihrer Ladung entweder zur Anode, bzw. zur Kathode wandern. Erfasst werden die Ionen von einem Durchflußphotometer. Der Puffer hat aufgrund einer zugegebenen optisch aktiven Substanz eine bestimmte Absorption, die erniedrigt wird, wenn die Ionen den Detektor passieren.
Die Trennung der Ionen wird durch ihre unterschiedliche Mobilität möglich gemacht, aufgrund derer sie unterschiedlich schnell wandern und zu unterschiedlichen Zeitpunkten den Detektor passieren. Die Mobilität eines Ions hängt ersteinmal von seinem Durchmessser und seiner Ladung ab, aber auch von einer Vielzahl umgebender Faktoren, wie der Viskosität der Lösung, der Feldstärke, des Trennpuffers, der Temperatur, des pH-Wertes und des elektroosmotischen Flusses.
Der elektroosmotische Fluß (EOF) dient der Beschleunigung der Ionenwanderung. Er basiert auf der Tatsache, daß das Material (Fused Silica) der Kapillare aus stark vernetzten Siliciumoxidmonomeren besteht, deren freie ionisierte Silanolgruppen mit negativen Ladungen in das Lumen der Kapillare ragen. An diese lagern sich die freien Kationen der Lösung an. Legt man nun die Spannung an, beginnt die Schicht der Lösung nahe der Wand in Richtung der Katode zu wandern, was einen Strom der gesammten Flüssigkeitssäule in Richtung der Kathode bewirkt. Zusätzlich wandern die Ionen natürlich auch noch mit ihrer Eigengeschwindigkeit, die von den oben genannten Faktoren abhängt.
Da sich der Detektor nur an einer Seite der Kapillare befindet, kann nur eine Ionensorte identifiziert werden, in dem oben genannten Fall nur die Anionen. Zur Identifizierung der Anionen muß man den EOF umkehren. Das geschieht durch eine Zugabe von kationischen Detergenzien zum Anionen-Puffer. Diese lagern sich an die negativ geladene Kapillarwand. Diese neue Schicht ist positiv geladen und so fest mit in der Wand verankert, daß sie sich bei Anlegen einer Spannung nicht wandert. Die mobile Schicht ist dann in diesem Fall negativ geladen und wandert zusammen mit der Flüssigkeitssäule in Richtung der Anode.
Man benutzt also für die Anionen- und die Kationen-Messungen unterschiedliche Puffer, denen auch unterschiedliche optisch aktive Substanzen zugesetzt sind. Folglich ist auch die Wellenlänge des Detektors unterschiedlich: Anionen-Messung: 254 nm; Kationen-Messung: 214 nm.
Sowohl zur Identifizierung als auch zur Quantifizierung von Ionen in Proben sind vorherige Messungen an Standardlösungen nötig. Die Art und Menge der enthaltenen Ionen sind bekannt. Die Messungen werden an unterschiedlichen Verdünnungen der Standardlösung durchgeführt.

Identifizierung der Ionen:
Wie bereits erwähnt, passieren die Ionen nach unterschiedlichen Zeiträumen den Detektor.
Von den Standardlösungen und ihren Verdünnungen kann man nun die relativen Laufzeiten bestimmen: Man setzt dabei die Laufzeiten der unterschiedlichen Ionen ins Verhältnis zu der niedrigsten vorkommenden Laufzeit. Bei den Anionen hat Chlorid die niedrigste Laufzeit bei den Kationen Ammonium. Dazu muß man zunächst dieses Ion in einer Probe identifizieren, erst dann können die relativen Laufzeiten bestimmt und mit denen der Standards verglichen werden.
Ist das Ion in einer Probe nicht vorhanden, kann man es in einem zweiten Durchlauf hinzufügen und ebenso verfahren wie vorher.
Man kann nicht die absoluten Laufzeiten verwenden, da sich diese mit zunehmender Versuchsdauer ändern. Durch die steigende Temperatur, die von der angelegten Spannung herrührt, sinkt die Viskosität der Lösung und die Mobilität der Ionen steigt.
Diese Methode ist relativ zuverlässig. Kann man einen Peak dennoch nicht genau identifizieren, kann man die qualitative Additionsmethode anwenden:
Hierbei fügt man den für den Peak vermuteten Stoff der Probe zu und führt den Versuch noch einmal durch. Ist der Peak größer als beim ersten Durchlauf, lag man mit seiner Vermutung richtig. Befinden sich an der Stelle des unbekannten Peaks nun zwei Peaks, sind die Stoffe nicht identisch und das Verfahren muß wiederholt werden.
Man kann die Methoden auch kombinieren:
Liegt die relative Laufzeit eines Peaks nur ungefähr bei einer der Standardlösung, kann man zur Kontrolle die qualitative Additionsmethode anwenden.
Die von uns identifizierbaren Ionen sind:

Anionen:         Kationen:
Chlorid            Natrium
Sulfat               Kalium
Nitrat               Calcium
Fumarat            Magnesium
Malat               Ammonium
Succinat
Acetat
Lactat
Propionat
Phosphat
Carbonat
Citrat

Quantifizierung der Ionen:
Die Fläche unter den Peaks der Ionen ist proportional zur in der Probe enthaltenen Stoffmenge.
Mit Hilfe der Standardlösungen ermittelt man Regressionsgeraden der Flächen über der Konzentration mit der dazugehörigen Formel für jedes Ion. Nach Umstellen der Formel kann man aus den erhaltenen Flächen die Konzentration des Ions in der Probe berechnen.
Es kommt vor, daß durch den Puffer in der Probe enthaltene Ionen "weggefangen" werden und die erhaltene Konzentration nicht mit der tatsächlichen in der Probe übereinstimmt. Man kann zur Ermittlung der tatsächlichen Konzentration nacheinander bekannte, unterschiedliche Konzentrationen des Ions hinzugeben und die Fläche unter den Peaks ermitteln. Trägt man die Fläche über den zugegebenen Mengen des Ions auf und zieht eine Gerade, so ist ihr Schnittpunkt mit der x-Achse die tatsächliche in der Probe enthaltene Konzentration mit negativem Vorzeichen.

Atom-Absorptions-Spektrometrie
Funktionsprinzip:

Die Atomambsorptionspektrometrie (AAS) dient der quantitativen Analyse eines Elementes in gelöster Form. Das Prinzip der AAS gehorcht einem von Kirchhoff formulierten Gesetz, welches besagt, daß jeder Stoff Strahlung der Wellenlänge, die er selbst emittiert, auch absorbieren kann. Bestrahlt man also Atome einer zu quantifizierenden Substanz mit Licht aus einer Strahlungsquelle des interessierenden Elementes, so können die Atome der Lösung etwas von den einstrahlendem Licht absorbieren. Der Extinktionsunterschied zwischen dem Licht vor und nach passieren der Lösung kann photometrisch gemessen werden und steht in Relation mit der Atomkonzentration in der Lösung. Das Element in der Lösung muß in Form von freien Atomen vorliegen, hierfür wird die Lösung vorab zerstäubt und in einer Flamme in ihre atomaren Teilchen zerlegt. Das Einstrahlungslicht trifft in der Flamme auf die freien Atome.

Apparatur:

Zum Aufbau der AAS gehören also

Als Strahlungsquelle benutzten wir ein Hohlkathodenlampe. Die Kathode besteht aus dem anzuregendem Element. Sie ist von einem gasgefüllten Glaszylinder umgeben. Bei Anlegen einer Spannung (bis 600 V) zwischen den Elektroden bilden sich in dem Glaszylinder an der Kathode positive Gasionen, welche auf die Kathodenoberfläche schlagen und somit Atome des Elementes herauslösen und zur Strahlung anregen.

Zur Atomisierung der Probe benutzten wir ein Gemisch aus Acetylen als Brenngas und Luft als Oxidant. Um die Anzahl der absorbierenden Atome zu maximieren, empfiehlt sich die Benutzung eines Schlitzbrenners, welcher durch eine Flammenbreite bis zu 10 cm einen langen Weg der Strahlung durch die Flamme ermöglicht. Eine Spiegeleinrichtung, welche den Strahlengang mehrmals durch die Flamme passieren läßt, erhöht ebenfalls die Wahrscheinlichkeit, daß ein freies Atom ein Photon absorbiert. Die Temperatur der Flamme sollte nicht zu hoch sein, um die mögliche Eigenemission durch freie, zu stark angeregt Atome zu verhindern; sie würde der zu messenden Absorption entgegenwirken und somit zu niedrige Extinktionswerte bewirken. Bedingt ist die Flammentemperatur durch die Wahl der Brenngase.

Als Filter wird ein Spektralphotometer benutzt. Einfallende kontinuierliche Strahlungen werden in diskrete Spektren zerlegt. Durch Regulierung der Spaltbreite vor dem Eingang des nachgeschalteten Detektors entscheidet man sich für die Spektren des zu analysierenden Elementes und schließt somit eventuelle Störungen oder Verunreinigungen in der Apparatur aus.

In dem Detektor erfolgt die Verstärkung der gemessenen Energiedifferenz und die Umwandlung in ein Anzeigesignal.
Der Bildschirm zeigt anschließend die Meßwerte an, und ermittelt nach jeweils 3 Werten den Mittelwert und die Standardabweichung. Das Atomabsorptionspektrometer arbeitet als eine relative Messung, d.h. die gemessenen Extinktionsänderungen sind nur durch Vergleich mit bekannten Bezugsgrößen auszuwerten. Hierfür wird eine Eichreihe bekannter Elementkonzentrationen analysiert.

Wir beschränkten uns in der ersten Woche auf die Nutzung der AAS hauptsächlich zur Erstellung einer Eichkurve für spätere Calziumbestimmungen.

Einstellungen am Gerät: (Skript Seite 30)

Verbrennungskalorimetrie
Für die Energiegehaltbestimmung von organischen Substanzen (u.a. Nahrungsmittel, Schneckengewebe ) haben wir mit dem Verbrennungs-bzw. Bombenkalorimeter gearbeitet. Neben den organischen kann man auch den Energiegehalt von chemischen Substanzen und von Brennstoffen wie z.B. Erdgas bestimmen.

Die Verbrennungsbombe ist ein dickwandiges Gefäß aus Stahl, das vor dem Setzen in das Verbrennungskalorimeter mit Sauerstoff gefüllt wird, wodurch in der Bombe ein Überdruck von 24,525 bar erzeugt wird. Der Bombenboden steht in thermischem Kontakt mit einem sogenannten Peltierelement (Bimetallstreifen), das mit seiner "kalten" Seite einem Aluminiumblock (Wärmesenke) aufliegt. Bei der Verbrennung findet durch die Bimetallstreifen eine Umsetzung der Temperaturdifferenz, die zwischen Ober- und Unterseite entsteht, in eine Thermospannung statt ("Seebeck-Effekt").

Ein Zünddraht von 0,1 mm Stärke wird zwischen beiden Elektroden in der Bombe so befestigt, dass er mit dem Substanz bzw. der Gelatinekapsel, in der sich die Probe befindet, auf dem Teller in Verbindung ist. Über diesen Zünddraht fließt der Entladestrom eines Kondensators und somit kommt es zur Verbrennung der Probe.

Die Temperaturerhöhung des Gefäßes wird von einem Schreiber aufgezeichnet. Man muß nicht warten bis die entstehende Kurve vollständig aufgezeichnet wird, sondern man kann nach dem Erreichen des Maximums den Versuch unterbrechen und den Energiegehalt rechnerisch ermitteln.Vor dem Zünden muß man die Bombe in dem Kalorimeter einige Minuten ruhen lassen und auf dem Schreiber sollte eine mehr oder weniger gerade Linie von 2-3 cm  zu beobachten sein.

Zur Auswertung legt man eine Gerade durch die Anfangssteigung (vor dem Zünden) und eine durch die Endsteigung der aufgezeichneten Kurve. Durch einen bestimmten Punkt X auf der Kurve fällt man ein Lot. Die Länge (in mV) dieses Lots zwischen seinen Schnittpunkten mit der Anfangs- bzw. Endsteigung entspricht dem Energiegehalt der Probe. Um den Zusammenhang zwischen den aufgezeichneten Spannung und der tatsächlichen Energie zu erhalten, erstellt man eine Kalibrierungsgerade mit Hilfe von Benzoesäure, die eine Verbrennungswärme von 26 470 J/g besitzt (Kalibrierung).
Das gefällte Lot muß so liegen, dass die Flächen zwischen der Kurve und der Anfangssteigung (A) gleich der derjenigen zwischen Kurve und Endsteigung (B) ist. Zur Vereinfachung wird dieser Flächeninhalt nur bei den Benzoesäuren direkt gemessen. Man misst dann auf welcher Höhe er auf der Min-Max-Gerade liegt und gibt diese Größe in % des Maximums an. Aus dem Mittelwert kann man für jede weitere Messung schnell den Punkt X auf der Kurve bestimmen.
Sowohl der Kalibrierfaktor als auch die Lage des Punktes X sind abhängig von der verwendeten Bombe und muss für jede extra ermittelt werden.

Differenz-Thermo-Analyse
Die DSC dient zur quantitativen Bestimmung der Wärmetönung eines Stoffes bei der Phasenumwandlung. Dabei wird ein Tiegel mit Probensubstanz und ein weiterer zur Referenz in einem Ofen auf eine gut wärmeleitende Platte gestellt. Ein Thermoelement mißt die Temperaturdifferenz der beiden Tiegel. Nun wird der Ofen nach einem bestimmten Programm aufgeheizt. Während des Phasenübergangs gibt die Probensubstanz Wärme ab (exotherme Reaktion) oder nimmt sie auf (endotherme Reaktion). Da der thermische Widerstand der gesamten Messzelle genau definiert ist, kann man diese Temperaturdifferenz als Enthalpieänderung oder Wärmestrom aufzeichnen. Im Diagramm wird der Wärmestrom über der Temperatur eingezeichnet. Eine positive Wärmetönung infolge einer exothermen Reaktion wird nach oben, eine negative Wärmetönung als Folge einer endothermen Reaktion nach unten eingetragen.
Die Enthalpieänderung ermittelt man, indem man die DSC mit einer Kalibrierungssubstanz aus demselben Temperaturintervall kalibriert und dH/dt bzw. dH/dT gegen T aufträgt. Dabei entspricht dH/dT der Wärmekapazität Cp. Aus diesem Thermogramm lassen sich die Peakonset-Temperatur, die Umwandlungsenthalpie DH, die Entropieänderung DS sowie die freie Enthalpie DG bestimmen. Die DSC dient hauptsächlich zur Bestimmung von spezifischen Wärmen, thermischen Effekten, Reinheit, Polymorphie, Glasumwandlung, Oxidationsstabilität, chemischen Reaktionen und Reaktionskinetiken sowie des Schmelzverhaltens und der Kristallisation.

Im Anhang befindet sich eine Tabelle mit näheren Erläuterungen zu den verwendeten Chemikalien

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