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Massenspektrometrie: Ein schneller Weg zum Erfolg

Probenabgabe und Auftragszettel

Grundvoraussetzung für den Erhalt von Massenspektren ist, dass wir die Proben erhalten.

Um die Proben abzugeben, muss pro Probe jeweils ein Auftragszettel ausgefüllt werden (erhältlich in der Probenabgabe im Eingangsbereich der Räume 13.12 und 13.13) oder hier. Im Moment sind die Auftragszettel in englisch, deutsch, spanisch und türkisch erhältlich.

Das nächste ist es, die Probe in die richtige gelbe Box auf dem Regal in der Probenabgabe zu stellen. Nach einiger Zeit, normalerweise innerhalb von drei Werktagen, können die Massenspektren sowie die zugehörigen Proben in der Probenabgabe abgeholt werden - sie liegen dann in dem Regal unterhalb der gelben Boxen. Übrigens finden sich wissenswerte Informationen etc. oberhalb der gelben Boxen - grüne und rote Pfeile unterstützen hier die Suche.

 

Geräte

Die Proben, die untersucht werden können, werden durch die zur Verfügung stehenden Gerätschaften, hier sind insbesondere die vorhandenen Ionisierungsmethoden zu nennen, limitiert. Auch sind Limitierungen durch Auflösung sowie eingeschränkte Massenbereiche durch die Verwendung spezifischer Analysatoren zu berücksichtigen.

An der Massenspektrometrie - Core Facility können wir folgende Geräte nutzen:

• - EI-MS: modifiziertes MAT 711 (damals Varian MAT)
• - ESI-IMS-MS/MS: UHPLC - Synapt G2-S HDMS (Waters)
• - ESI-FTICR-MS: Ionspec QFT-7 (Agilent/Varian)
• - GC-MS: Saturn 2100 GC/MS (Agilent/Varian)
• - HPLC-MS: LC/MS 6210 System (Agilent)

Im Moment können wir keine Ionisierung mittels (AP)PI (Photoionisierung), ICP (induktiv gekoppeltem Plasma) oder MALDI (Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisierung) anbieten, wobei die letztgenannte Methode nicht nur für biologische Proben interessant ist. NSI (nano-ESI) ist am FTICR und am IM-MS/MS möglich. Das FTICR-MS bietet daneben noch die Möglichkeit für APCI (Athmospheric Pressure Chemical Ionization).

Der Zugang zu dem MALDI-TOF/TOF (Dr. C. Weise) und dem ICP-MS (T. Wons) wird von den genannten Mitarbeitern der Biochemie geregelt.

 

EI-MS: modifiziertes MAT 711 (Raum 13.09)

Das MAT 711, von der Firma Varian MAT in den späten Siebzigern des vorigen Jahrhunderts gebaut, wurde im Jahr 1977 an seinem jetzigen Standort in der Freien Universität installiert. Mehr als dreißig Jahre später ist es immer noch im Dienst und Teil unserer Geräteflotte. Aufgrund von einigen größeren Umbauten sowie der ständigen Pflege von unter anderem Herrn Dipl.-Ing. E. Seelbach ist es immer noch möglich, Moleküle in einem m/z - Bereich von 10 bis etwa 2500 zu analysieren.

Weil EI (Electron Impact, Elektronenstoßionisierung) zur Ionisierung genutzt wird, ist in den erhaltenen Massenspektren neben den charakteristischen Fragmentionen (Ionen mit gerad- oder ungeradzahliger Elektronenzahl), die oft Rückschlüsse auf die chemische Struktur erlauben, oft auch das M^*+ Radikalion zu finden. Diese Messungen finden bei niedriger Auflösung statt, R ist ungefähr 1000. Um gute Ergebnisse zu erhalten und um Schaden am Gerät zu vermeiden ist es unabdingbar, flüssige oder feste Reinsubstanzen als Proben abzugeben. Auch müssen diese ausreichend flüchtig sein, da die Analyten vor der Ionisierung in die Gasphase gebracht werden müssen.

Messungen mit Hochauflösung (bis zu R = 12.000) sind möglich, aber sehr zeitaufwendig. Eine ausreichende Intensität des zu untersuchenden Ions ist Grundvoraussetzung - und es kann jeweils nur ein Ion nach einer Messung mit Niedrigauflösung unter Hochauflösung bestimmt werden. Es ist nicht möglich, komplette Spektren hochaufgelöst zu erhalten. Die Zahl dieser hochauflösenden Messungen sollte auf wenige, wichtige Proben beschränkt werden.

Die DFG hat uns das Geld zur Beschaffung eines Ersatzgeräts zugesagt, nach erfolgter europaweiter Ausschreibung wird es das oben beschriebene Museumsstück ersetzen.

Aufgrund des Alters des Geräts sind Messungen im Negativ-Modus nicht mehr möglich. Die Messungen an diesem Gerät werden ausschließlich vom Servicepersonal durchgeführt.

 

 

ESI - IMS-MS/MS, UPLC-Synapt G2-S HDMS (Raum 13.09)

Mit dem ESI-IMS-MS/MS, ein UPLC-Synapt G2-S HDMS der Firma Waters, ist ein neues Gerät in das Kernkompetenzzentrum für Massenspektrometrie eingezogen. Es wird derzeit in Betrieb genommen (Stand: Januar 2012). Nach einer gewissen Einarbeitungszeit wird es auch für Servicemessungen bzw. zur selbstständigen Nutzung durch wenige Arbeitsgruppen zur Verfügung stehen.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Die Anlage besteht aus zwei aneinander gekoppelten Geräten:

1. Einem sehr leistungsstarken Chromatographiesystem, einer Acquity UPLC.

Diese besteht aus einem binären Pumpensystem, was Drücke bis zu 1000 bar (15000 psi) erlaubt. Damit steht der Nutzung von Säulenmaterial mit sehr kleinen Partikelgrößen (bis 1,7 µm) und damit sehr effizienten und schnellen Trennungen nichts mehr im Wege.

Weitere Bestandteile sind der auf 4°C temperierbare Autosampler, ein Säulenofen sowie ein Photodiodenarraydetektor (PDA), mit dem Wellenlängen im sichtbaren und UV-Bereich des Lichtspektrums detektiert werden können.

Bedingt durch die Kapillaren mit sehr kleinem Innendurchmesser sowie die kleinen Partikelgrößen des Säulenmaterials können nur speziell gefilterte Eluenten und Proben verwendet werden, um eine Verstopfung zu vermeiden.

2. Einem ESI-IMS-MS/MS (Synapt G2-S HDMS).

Das Hybridgerät beinhaltet vereinfacht gesagt ein Q-TOF mit einem Ionenmobilitätsspektrometer.

Als Optionen für die Ionisierung stehen uns derzeit eine Z-Spray-ESI-Ionenquelle sowie eine NSI-Ionenquelle zur Verfügung. Beide sind mit einem zweiten Sprayer (Lockspray) ausgestattet, was eine externe Kalibrierung während der Messungen und damit eine sehr gute Massengenauigkeit (ca. 1 ppm) gewährleistet. Die Auflösung des Flugzeitmassenspektrometers (TOF) ist mit ca. 40.000 sehr hoch. Interessant ist auch der sehr große Massenbereich (m/z > 30.000), wodurch auch sehr große, nonkovalent gebundene Komplexe einer Analyse zugänglich gemacht werden können. Ein weiterer Vorteil des Geräts ist die Ionenmobilitätszelle. Hier können die Ionen nicht nur nach ihrem m/z, sondern auch nach dem Stoßquerschnitt getrennt werden. So ist neben einer sehr schnellen Trennung hochkomplexer Analytgemische z.B. auch eine Auftrennung verschiedener Isobaren möglich. Als Beispiel seien hier Peptide mit reversen Sequenzen genannt. Das IMS ist aber auch im Bezug auf die experimentelle Bestimmung der Driftzeiten und damit der Stoßquerschnitte der analysierten Ionen interessant.

In den Massenspektren sind bei Nutzung von ESI oder NSI vor allem die kationisierten Ionen, [M+H]⁺ oder [M+(Cat¹⁺)]⁺ sowie mehrfach geladene Ionen zu finden. Fragmentionen sind eher eine Ausnahme. Bedingt durch die sehr hohe Empfindlichkeit des Geräts wird auch hier chemisches Rauschen zum Untergrundspektrum beitragen. Die Grundanforderungen an die Proben werden größtenteils identisch zu denen sein, die in den Unterpunkten FTICR-MS bzw. HPLC-MS erwähnt sind.

 

FTICR-MS: Ionspec QFT-7 (Raum 13.06)

Unser FTICR-MS, ein Ionspec QFT-7 von Varian Inc. wurde im Oktober 2006 installiert. Ausgestattet mit entweder einer Micromass/Waters Z-Spray Elektrospray-Ionenquelle, einer Micromass/Waters Z-Spray APCI-Ionenquelle oder einer MS Horizons NSI-Ionenquelle sind an diesem Gerät Messungen mit extrem hoher Auflösung möglich. Auch sind neben verschiedenen, beeindruckenden Möglichkeiten zur Ionenmanipulation MSⁿ-Messungen möglich.

Sowohl die Elektrosprayionisierung (ESI) als auch die Nanosprayionisierung (NSI oder nano-ESI) erlauben eine sehr schonende Ionisierung von polaren und ionischen Analyten welche in Methanol, 2-Propanol oder Acetonitril gelöst sind. Aceton und/oder THF und bis zu 50% Wasser oder 20% Dichloromethan bzw. Chloroform sind bei ESI tolerabel, während bei NSI bis zu 95% Wasser im Lösungsmittel verwendet werden können. Die Analyten sollten gegen Sauerstoff und Feuchtigkeit stabil sein. Leicht oxidierbare Analyten können während der Ionisierung oxidiert werden. Analyten mit höheren Molekulargewichten erscheinen häufig als mehrfach geladene Ionen. So werden bei Anlegen einer positiven Spannung (bei ESI wird eine Spannung von ca. 4 kV auf die Spraykapillare gelegt, bei NSI ca. 800 V ) sehr häufig vielfach geladene, kationisierte Ionen wie [M+nH]ⁿ⁺ bzw. [M+n(Cat¹⁺)]ⁿ⁺ detektiert. Für APCI müssen alle Bestandteile der Probe inklusive Analyt flüchtig genug sein. Typischerweise werden hier [M+H]⁺ -Ionen gebildet.

Für alle Analysen sollten die Proben möglichst sauber sein. Speziell oberflächenaktive Substanzen wie z.B. SDS oder auch anorganische Salze unterdrücken die Ionisierung der eigentlich interessanten Spezies.

Die Quadrupolregion des Massenspektrometers erlaubt es, gezielt Ionen vorzuselektieren und zu speichern. Auch können hier Experimente mit Kollisions-induzierter Fragmentierung (CID) durchgeführt werden, bevor die Ionen in den supraleitenden Magneten (Feldstärke B: 7 T) transferiert werden.

Die Quadrupole sowie die Transferhexapole sind auch die limitierenden Faktoren für den Massenbereich: die höchsten detektierbaren Masssen überschreiten ein m/z 6,500 nicht wesentlich. Ionen mit höherem m/z - Verhältnis können allerdings bei der Fragmentierung von sehr hoch geladenen Ionen in der ICR-Zelle entstehen und detektiert werden.

Die ICR-Zelle (Ionen-Zyklotron-Resonanz-Zelle) ermöglicht eine Vielzahl verschiedener Fragmentierungsmethoden wie BIRD, ECD, IRMPD und SORI-CID. Zusätzliche Puls- und Leckventile erlauben Gasphasenreaktionen der gespeicherten Ionen mit Gasen und leicht flüchtigen Flüssigkeiten und H/D-Austauschexperimente. So ist uns der Zugang zu einer Vielzahl von Möglichkeiten zur Strukturaufklärung, Untersuchung von Reaktionsmechanismen und zur Studie von thermodynamischen Daten der Analyten gewährleistet.

Eine limitierte Anzahl von speziell ausgebildeten Nutzern kann das Gerät neben dem Servicepersonal betreiben. An einem Rechner in Raum 13.09 steht die Auswertesoftware zur Verfügung.

 

GC-MS: Saturn 2100 GC-MS (Raum 13.03)

Als GC-MS steht uns ein Saturn 2100 GC/MS System der Firma Varian Inc. zur Verfügung. Es besteht aus einem Gaschromatographen, der mit einer Trennsäule ausgestattet ist, die zur Trennung von Stoffgemischen aus unpolaren Lösungsmitteln wie z.B. Hexan oder Ethylacetat geeignet ist. Die Analyse von Gemischen aus wässrigen Lösungen würde das Injektionssystem sowie die Trennsäule zerstören.

Die Proben müssen salzfrei sein und dürfen ausschließlich leicht flüchtige Verbindungen, die nicht mit dem Material des Injektors oder der Trennsäule reagieren, enthalten. Als Lösungsmittel werden THF, Diethylether, Diethylester sowie Hexan oder Pentan vorgeschlagen. Wasserhaltige Proben können wie oben bereits erwähnt nicht untersucht werden.

Da die Ionisierung mittels Elektronenstoß (EI) nach der Trennung erfolgt, ist eine Grundvoraussetzung für die Ionisierung bereits gegeben: die Analyten liegen bereits gasförmig vor. Als Folge aus der Ionisierungsmethode werden auch hier einige strukturtypische Fragmentionen mit gerad- oder ungeradzahliger Elektronenanzahl sowie das M^*+ - Radikalion gefunden. Durch den verwendeten Analysator, einer Ionenfalle, sind nur Messungen bei niedriger Auflösung möglich. Weiterhin limitierend ist der eingeschränkte Massenbereich von ca. m/z 20 bis zu 650. Dieser Nachteil wird teilweise durch einen automatisierbaren Abgleich der generierten Daten mit einer integrierten Datenbank kompensiert.

Nach einer Einweisung und etwas Training kann das Gerät von den Nutzern selbst betrieben werden.

 

HPLC-MS: Agilent 6210 System (Raum 13.03)

Ein HPLC-MS ist ebenfalls im Betrieb. Es ist ein Agilent 6210-System, bestehend aus einem analytischen Agilent 1100 HPLC-System mit einem zusätzlichen Diodenarraydetektor (DAD) sowie einem ESI-MSD TOF von Agilent Technologies.

Es ermöglicht Messungen mit hoher Auflösung und sehr hoher Massenpräzision. Der Fehler ist unter 5 ppm bei externer und unter 2 ppm bei interner Kalibrierung. Die interne Kalibrierung wird durch einen zweiten, zum Hauptsprayer orthogonal angeordneten Sprayer gewährleistet (Lockspray). Der Massenbereich (m/z 50 bis 3,500) bedeutet, dass nahezu jede polare oder ionische Verbindung detektiert werden kann, da ESI (Elektrosprayionisierung) genutzt wird, um das HPLC-System mit dem Massenspektrometer zu verbinden. Für Analyten mit höherer Masse werden auch hier im positiven Ionisierungsmodus (eine Spannung von ca. 4 kV wird an der Eingangskapillare angelegt) die Bildung von mehrfachgeladenen, kationisierten Ionen der Art [M+nH]ⁿ⁺ bzw. [M+n(Cat¹⁺)]ⁿ⁺ beobachtet. Auch hier sollten die Proben möglichst sauber sein. Alle anderen Vorbedingungen sind bereits in dem Abschnitt über FTICR beschrieben worden.

Experimente mit Direktinfusion werden von trainierten Nutzern sowie dem Servicepersonal durchgeführt. Dabei sollten nur gefilterte (4 µm Filter) Analytlösungen untersucht werden. Auch sollte die Analytkonzentraion zur Vermeidung von Verschleppung sowie zur Vermeidung von Verschmutzungen des Instruments sowie um den Detektor zu schonen möglichst gering gehalten werden. Eine maximale Konzentration von 100 µmol/L wird gestattet. Die maximal erlaubte Zahl für die Counts ist 1,000,000 (10⁶)! Wenn höhere Counts detektiert werden, muss die Probe sofort verdünnt werden! Positiver Nebeneffekt dieser Vorgehensweise ist, dass durch Vermeidung der Detektorsättigung die Massengenauigkeit deutlich größer ist.

LC/MS-Messungen können von eingewiesenen Nutzern selbstständig durchgeführt werden. Zusätzlich zu den Voraussetzungen für Direktinfusion ist bei diesen Experimenten zu bedenken, dass die Proben für die HPLC-Trennung geeignet sind. Reaktionen der Analyten mit dem Säulenmaterial sowie ein Verbleib auf der Säule sind nicht tolerierbar. Der pH aller Proben sowie der verwendeten Lösungsmittel muss in einem Bereich von ph 7 bis pH 4 liegen. Als Puffer sind alle leicht flüchtigen Puffer mit Anionen wie z.B. Carbonat, Acetat ode Formiat sowie Kationen wie Ammonium, Triethylammonium und so weiter verwendbar, allerdings mit einer Maximalkonzentration von 10 mmol/L. Nicht verwendet werden dürfen Puffer mit schwer flüchtigen Bestandteilen wie unter anderem Phosphat, Sulfat, Na⁺ oder K⁺.

 

FAB-MS: CH-5 (Im Ruhestand)

Das FAB-MS, ein CH-5 der Firma Varian MAT, ist nach mehr als dreissig Jahren Dienst an der Freien Universität Ende 2011 in den wohlverdienten Ruhestand gegangen.

Die neueren Ionisierungsmethoden, ESI und MALDI, haben heutzutage FAB (Fast Atom Bombardment, Schneller Atom-Beschuss) fast vollständig verdrängt. Insbesondere bei einigen polaren oder ionischen Analyten, z.B. leicht oxidierbaren metallorganischen Verbindungen, war es von großem Nutzen. Die Präparation war, wie die Messung selbst, sehr zeitaufwendig. Die richtige Matrix musste gefunden werden, auch brauchte man für die Präparation eine vergleichsweise große Substanzmenge (aber immer noch nicht soviel wie für NMR!).

Die Massenspektren zeigten vor allem die kationisierten Ionen, [M+H]⁺ oder [M+(Cat¹⁺)]⁺. Fragmentionen waren ebenfalls häufig detektierbar. Typisch für diese Methode waren auch die Matrixclusterionen, die als chemischer Untergrund in manchen Fällen die Spektren auch dominieren konnten.